5月1日下午五点，也就是九连城战斗结束之际，联合舰队也再度出击，进行第三次闭塞作战。
虽然在出发之前，日本陆军取得九连城之战胜利的消息尚未传来，但从以收到的消息来看，胜利己是囊中之物了，这也给联合舰队带来了不小的压力，毕竟陆军一出手就是货真价实的胜利，比海军取得的这些华而不实的胜利要强得多了，因此这次闭塞作战就显得犹为关建了。
不过联合舰队也对这次闭塞作战下足了工夫，充份吸取了前两次闭塞战的经验，仅闭塞船的数量达到了12只，超过了前两次闭塞船的数量，并且还专门研究出了一个“四三三二”闭塞作战队形，由参加过前两次闭塞作战的斋藤七五郎大尉为监督进行训练，因此联合舰队上下对这次闭塞作战也充满了信心，志在必得。
但事与愿违，第三次闭塞作战从一开始就不顺，首先是在出发之后，闭塞船釜山丸的发动机出了问题，尽管釜山丸的指挥官大角岑生大尉坚持要参加战斗，但由于航速不足而渐渐掉队，最后发动机彻底坏掉，只能停在海洋岛。
5月2日晚上9点，闭塞作战开始，但这时天气变得恶劣起来，海面上刮起了猛烈的大风，11艘闭塞船无法保持队列，
这时新发田丸上的闭塞作战总指挥，林中佐考虑到这种海况天气，并不利于作战，于是决定中止作战，下令闭塞船队回航，但这时闭塞船队的队形己乱，结果仅有小仓丸、长门丸两艘船看到了信号，随新发田丸转向回航，而其余8艘闭塞船在风浪中分成两队，仍然向旅顺港驶去。
而在旅顺，马卡洛夫战死后，在新任司令斯科尔伊多夫到任前，暂时由阿列克谢耶夫代行舰队司令职务，马卡洛夫上任的时间虽然不长，但毕竟给旅顺港打造了一个完善的防御体系，而阿列克谢耶夫的才能尽管远不及马卡洛夫，但也不是笨人，完全继承了马卡洛夫打造的防御体系，并且还在港内布下了防雷网，也同样在港外布设*，使旅顺港的防御更为严密。
结果闭塞船队在外港遭到了俄军猛烈的炮火打击，8艘闭塞船要么是被炮火击沉，要么是无法突进而被迫引爆自沉，最终没有一艘能够在预定位置沉没。
第三次闭塞战作战规模和损失均比前两次大很多，突入港口的八艘船共有158人，最后的生还的只有63人，其中有两艘船的人员全部阵亡。后来日本攻下旅顺之后，又找到了16名幸存者，并在俄国墓地找到了39具闭塞船员的遗体。
根据幸存者和俄军俘虏介绍，在第三次闭塞战作战结束之后，太平洋舰队也派出小艇救援落水者，但部分日本船员不接受救助，要么自杀，要么反抗，最后只有30多人获救，在被送往旅顺海军医院后，还有十几个人绝食而亡。
尽管在第三次闭塞战作战结束之后，为了不被陆军取得的胜利比下去，东乡平八郎给军令部的电报称“第三次闭塞战作战基本成功”，但在私下里却承认，这三次闭塞作战实际都并未产生多少效果，最多使得大舰进出稍微困难了一些。